ratio のヒートマップで変動パターンをチェックする

シグナル値ではなく、ratio でヒートマップを書いて、変動パターンにをチェックすることもあります。

ratio のヒートマップ

シグナル値ではなく、ratio を用いたヒートマップの例を示します。データとしては、解析例1の3つの比較において、いずれかの比較で変動のあった遺伝子(約2678個)だけを用いています。

左から、3つの比較(ratio1, ratio2, ratio3) を並べています。ratio1 = sample1/control1, ratio2=sample2/control2, ratio3=sample3/control3 となります。

色付けは、ratio < 0.5 を明るい、ratio > 2 が明るいになるようにしています。

また、図は全体が見えやすいようにリサイズしています。

ratio のヒートマップ。遺伝子方向にクラスタリングを適用。
ratio のヒートマップ。遺伝子方向にクラスタリングを適用。

シグナル値を用いた場合のヒートマップと異なり、ヒートマップにコントロールは表示されません。3列ともであれば、3つの比較において、共通に増加した遺伝子だと分かります。逆に3列ともであれば、共通に減少した遺伝子です。

変動パターンをチェックしやすい反面、計算していない比較の組み合わせ(例えば、sample2 と sample3 ではどちらが高いか)は読み取るのが難しい場合があります。

参考

 

マイクロアレイデータの解析例 1.8 (KEGG パスウェイに ratio で色付けする)

発現変動遺伝子を抽出した結果、特定のパスウェイの変動を確認するには、 KEGG パスウェイデータベースを利用できます。

KEGG のパスウェイのうち、「どのパスウェイに発現変動遺伝子が多く含まれるか」は、DAVID の結果からも確認できます。しかし、その場合は、パスウェイ上の発現変動遺伝子が☆印で示されるだけであり、増加しているのか、減少しているのかは、すぐには確認できません。(元のエクセルファイルで ratio をチェックすることになります。)

KEGG パスウェイに ratio で色付けする

KEGG には、 KEGG Mapper というサービスがあります。このサービスを使えば、特定のパスウェイの遺伝子に、増加したものは減少したものは、といった具合に色付けができます。

KEGG Mapper による色付けの指定。
KEGG Mapper による色付けの指定。

KEGG Mapper の Search against に生物種名を指定します。human なら、hsa になります。(mouse は、 mmu)

フィールドの中に、 EntrezGeneIDcolorスペース区切りで入力します。複数の遺伝子に色付けする場合は、さらに , (カンマ)と改行で区切って続けます。

どの遺伝子を、どの色にするかは、発現変動遺伝子のリストを元に ratio の値を確認して、決めてください。上の例では、解析例1の 24hr の比較 (sample2/control2) において増加していた3つの遺伝子を指定しています。(この段階で、色付けしたいパスウェイの名前を指定する必要はありません。)

下部の Exec をクリックすると、検索結果の一覧が表示されます。

パスウェイの検索結果。
パスウェイの検索結果。

前述のフィールドに入力した遺伝子が、多くヒットしたパスウェイの順に検索結果が表示されます。さらに、パスウェイの名前をクリックして、色付けの結果を確認します。

ratio で色付けされたパスウェイの例。
ratio で色付けされたパスウェイの例。

エクセルのデータから確認できるように、このパスウェイ上の遺伝子のうち、変動していたのは3つだけでした。増加していたものがありましたが、減少したものはありません。DAVIDの結果によると、Apoptosis のアノテーションを持つものは 20 個程度あるはずですが、そのうちの3遺伝子が KEGG に登録されていたことになります。(全ての遺伝子がパスウェイ上に表示されるわけではありません。)

この結果からも、アポトーシスが活性化されたというには、今ひとつ説得力に欠けるように思います(数が少ない)。CASP3 につながる CASP12 は増加していますが、 CASP3 は変動していません。ただ、 CASP3 のシグナル値を確認すると、5000程度はあるので、発現していないわけではないと考えられます。タンパクレベルで、活性化されるのであれば、mRNAの変動はなくても説明がつくのかもしれません。

 

Intensity-based Z-score (シグナル値を考慮した Z-score )

マイクロアレイにおいて、シグナル値の低いものは、信頼性(データの再現性)がよくない場合があります。これは、MAプロットや散布図の形状からも推測されます。(同一条件で比較したサンプルにおいても、シグナル値の低い部分に変動が見られがち。)

例えば、シグナル値が、1000から10000になったら、ratio=10ですが、10から100になっても同じ ratio=10 です。ratio だけで、発現変動遺伝子を判定すると、特にシグナル値の低い部分に、ratio が高い遺伝子が見つかりがちですが、再現性を考えた場合、少し不安です。

一方、 Z-score で判定した場合も、MA プロットから分かるように、シグナル値の高い部分は、Z-score が高くなりにくい傾向があります。

この2点の問題を解消するために、  Intensity-based Z-score (Intensity-dependent Z-score)* というものがあります。(以前から提案されているもので、珍しい手法ではありません。)

Intensity-based Z-score

Intensity-based Z-score では、文字通り、Intensity (=シグナル値の強さ) を考慮した Z-score です。マイクロアレイデータをシグナル値の大きさごとに一定の区間に分割して、その区間ごとに logFC の平均値と標準偏差を求めます。そして、それぞれの区間ごとに、Z-score を算出します。

そうすることで、シグナル値の低い部分は、大きい標準偏差 (SD) を用い、一方、シグナル値の高い部分は、小さい SD を用いて Z-score を判定することになります。したがって、シグナル値の低い部分は、通常の Z-score より判定条件が厳しくなり、シグナル値の高い部分は、判定条件が緩くなります。

MAプロットで確認すると、違いがよくわかります。ここでは、便宜的に、シグナル値の大きさによって8区間に分割して、Z-score を算出しています(図下)。(8つという区間に必然性はありません。もう少し細く区切ってもよいです。)また、Intensity-based Z-score を使用した図は、事前に使用した2サンプルのフラグが、共にA(absent: 未検出)のプローブを除外しています。

Z-score で色付けした MA プロット。
Z-score で色付けした MA プロット。
Intensity-based Z-score で色付けしたMAプロット。(フラグでカットしている。)
Intensity-based Z-score で色付けしたMAプロット。(フラグでカットしている。)

図形的には、変動している遺伝子を外側から数パーセント取るという形になります。単純に ratio で判定するよりも慎重な方法といえるでしょう。しかしながら、これも万能な手法というわけではありません。可能であれば、繰り返しサンプル (replicates) が、3サンプル以上 (n=3以上) あって、検定などの手法が使える方が望ましいことには変わりません。

参考

* Quackenbush. Microarray data normalization and transformation. Nat Genet (2002) vol. 32 Suppl pp. 496-501.

 

Z-score の利点と欠点

MAプロットで確認すると、 ratio と Z-score の関係が、分かりやすいと思います。解析例1のデータ (sample2/control2) においては、ratio=2 のラインより、2SDのラインが外側にあります。この場合は、 Z-score のほうが厳しい判定と言えます。(追記:この例の場合、2SD=約1.344 (logFCで)、ratio > 2.54 が Z-score > 2 のラインです。)

MAプロットに示した Z-score の関係。
MAプロットに示した Z-score の関係。

また、 logFC を Z-score 化して、発現変動遺伝子の判定を行う場合、利点と欠点があります。

Z-score を判定に用いた場合の利点

単純に ratio で判定する場合に比べて、下記のような利点があります。

  • 判定の基準で迷わない。
  • 発現変動が大きいデータの場合、カットオフに使える。
  • 発現変動が小さいデータでも、発現変動遺伝子を判定できる。

Z-score > 2 または、 Z-score < -2 ということに、統計学的な意味があるので、判定の基準をいくらぐらいにしようかということで迷う必要はありません。(2 以下にあまり意味がありません。)

また、発現変動が大きいデータの場合、ratio > 2, ratio < 0.5 などで判定すると、4000個、5000個の遺伝子が、発現変動ありとなることもあります。そのような大きいデータの場合、 Z-score で判定することで、発現変動遺伝子の数を1000個から2000個程度に減らせます。(発現変動遺伝子が多すぎても困ることがあります。例えば、DAVID で1度で解析できる遺伝子の数は、3000個です。)

逆に、サンプルによっては、たかだか1.5倍程度しか変動しないような、小さい発現変動のデータもあります。そのような場合、Z-score だけで判定すれば、(ratioの大きさに関係なく)変動している遺伝子の上位5%程度を取ることになるので、必ず、変動遺伝子を得られます。

Z-score を判定に用いた場合の欠点

利点の裏返しです。

  • 判定が厳しすぎるときがある。
  • シグナル値が高い部分で、|Z-score| > 2 に比較的なりにくい。

例えば、研究対象としている遺伝子があり、 ratio だと 2 倍を超えているのに、 Z-score だと、 1.7 というようなケースです。Z-score  が2以下だからといって、「変動していない」という証明になるわけではありませんが、印象が良くないかもしれません。

また、散布図やMAプロットの先が細いということからも見えることですが、シグナル値の高い部分は、変動が小さく見えがちです。シグナルの高い部分にも、シグナルの低い部分と同程度の標準偏差を求めるならば、高い部分は、|Z-score| > 2 になりにくいといえます。

しかしながら、そもそも、変動が大きすぎたり、変動が小さい場合は、まず、サンプル数(n数)を増やすことを考えるべきです。n=3以上にして、limma, SAM, t-test などの検定を行ったほうが、p-value も算出できますし、より再現性の高い遺伝子を変動ありと判定できます。

 

Z-score (発現変動遺伝子を判定するもう1つの方法)

ratio (logFC) 以外に発現変動遺伝子を判定する方法として用いられるものに、 Z-score があります。あまり聞きなれない用語かもしれませんが、偏差値というとどうでしょうか?

ある値が、その群の平均値から、標準偏差 (SD) の何個ぶん離れているかを求めたものが、 Z-score です。Z-score の考え方自体は、特殊なものではありません。Z-検定 (Z-test) という使われ方もあります。(Z-score 化されるのは、logFC に限りません。例えば、 cBioPortal では、シグナル値が Z-score 化されています。)

ここで用いるのは、 logFC を Z-score 化したものです。ある logFC  が、 logFC の平均値から、標準偏差の何個ぶん離れているか計算します。

ratio (logFC) のヒストグラム

ratio (logFC) のヒストグラムを示します。データは、解析例1のものを使っています。

ratio (logFC) のヒストグラム。
ratio (logFC) のヒストグラム。

ほとんどの遺伝子の logFC が0(つまりratio=1)、変動していないことが分かるかと思います。ratio で判定するなら、 ratio > 2 または、 ratio < 0.5 を満たす部分に含まれる遺伝子を発現変動遺伝子と判定していることになります。(ヒストグラムの右側と左側)。

標準偏差と Z-score

次に、同じヒストグラムに標準偏差 (SD) と Z-score の関係を示してみます。

標準偏差とZ-scoreを示したヒストグラム。
標準偏差とZ-scoreを示したヒストグラム。

解析例1のデータ (sample2/control2) の場合、計算してみると、logFC の平均値は、ほぼ0になります。SDは、約 0.672 です。また、分布関数の考え方から、平均値から標準偏差2個分離れていれば、稀な値 (p-value < 0.05) ということになります。

したがって、 Z-score で判定する場合は、下記のようになります。

  • 増加した遺伝子: Z-score > 2
  • 減少した遺伝子: Z-score < -2

絶対値の記号を用いれば、両方を合わせて、  |Z-score| > 2 とも書けます。

追記:2SDだと、2 x 0.672 = 1.344 なので、 logFC > 1.344 であれば、 Z-score > 2 です。ratio で言い換えると、ratio > 2.54 であれば、Z-score > 2 となります。

参考

https://www.khanacademy.org/math/probability/statistics-inferential/normal_distribution/v/ck12-org-normal-distribution-problems-z-score