NGSデータ解析時のファイルのフォーマット (2)

FASTQ, BAM (SAM) に続いて、よく利用されるのが、BED (べっど)形式のファイルです。

BED

BED は、Browser Extensible Data の略です。Browser (ブラウザ)は、UCSC のゲノムブラウザのことです。染色体(ゲノム)上の位置情報に、何らかのスコアを加えて表現するためのファイルです。

これもテキスト形式のファイルで、1行ごとに、位置情報 (chrom, chromStart, chromEnd) とスコア (name, score)、その他の情報をオプションで記述します。

最低限のデータとしては、下記のようなものです。(各項目の区切りはタブ文字)

chr1 100 200 geneA 1000
chr2 1000 2000 geneB 10

chrom は染色体の番号、chromStart は、指定したい配列の開始位置、chromEnd は終了位置です。name は、ブラウザに表示するときのラベル名、score は、表示したい任意の数字 (0-1000) です。ここまでが、BEDファイルに必須の項目です。残りのオプション部分にいろいろな情報を指定できるので、同じ BED ファイルでも様々なバリエーションがあります。

https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1

基本的には座標を指定するものなので、プロモーターやエンハンサーの位置を示したり、ChIP-seq の結果のピークの位置とスコアを表したり、様々なことに使用されています。

BED を元にさらに拡張されたフォーマットとして、bigBed, bedGraph があります。同様に、ゲノム上の位置(区間、領域)に情報を記述するものとして、WIG とそれを拡張、圧縮した bigWig などがあります。

bedtools

ゲノム上の位置情報どうしを演算するためのツールとして、 bedtools というソフトウェアがあります。bed で指定した配列の座標から、1000 base 上流の座標を求めたり、指定した座標の両端 500 から 1000 base の座標求めることができます。

さらにリファレンスゲノム(FASTAファイル)から、求めた座標に該当する領域の配列を抽出することも可能です。具体的な配列操作のイメージは、下記の解説が分かりやすいです。

getfasta

その他の操作もイメージつきで解説されています。(このようなソフトウェアの解説は、まず、作成者の準備したドキュメントに目を通すことをお勧めします。有用なことが多く書かれています。)

http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/bedtools-suite.html

Mac であれば、brew を使ってインストールできます。

brew install bedtools

* science タップを追加する必要があります。ない場合は上記のコマンドのログにその旨が表示されますので、それに従います。

 

NGSデータ解析時のファイルのフォーマット (1)

NGSのデータ解析時に用いられるファイルの形式は様々なフォーマットがあります。名前もよく似ているものが多く、初めは混乱するかもしれません。代表的なシーケンスのデータベースである UCSC に各種フォーマットの解説があります。

https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html

RNA-seq において、代表的なフォーマットは、FASTQ (ふぁすときゅー)とBAM(ばむ)です。

FASTQ

FASTQ は、シーケンサーで検出されたリードの配列を保存したものです。もとは、ATGCの文字を記述するだけの FASTA(ふぁすた)というフォーマットがあり、それに加え、シーケンサーで読み取った各塩基のクオリティーのスコアを格納したものです。リードを1本1本、記録しているため、数千万行から数億行の大きなサイズのファイルです。テキストファイルですので、テキストエディタで開くと、文字が読めます。(圧縮されている場合は、一度展開する必要があります。エディタによってはそのまま読めるものもあります。)

ファイルの拡張子は、.fastq, .fq などです。圧縮されていれば、.fastq.gz, .fq.gz のようになります。(FASTA の場合は、.fasta, .fa, fa.gz など。)また、_1.fq.gz, _2.fq.gz のように番号がついているものは、ペアエンドモードでシーケンスされた結果です。この場合、1サンプルあたり、2つのFASTQファイルがあります。

BAM (SAM)

シーケンサーから出力されたリード(FASTQ) を、リファレンスとなる配列にマッピングした結果は、SAM(さむ)形式のファイルになります。1本1本のリードが、ゲノム上のどこにマップされたかを示します。FASTQ の中身も含むので、ファイルのサイズは数十ギガバイト (GB) と大きくなります。ファイルの拡張子は、.sam です。SAMフォーマットの仕様は、GitHub で確認できます。

BAM は、上記の SAM を圧縮したものです。データの中身は、SAMと同一のものです。通常、マッピングした結果として提供されるのは、このBAMファイルです。1サンプルにつき1個の BAM ファイルになります(ペアエンドでもマッピング後のファイルは1個)。ファイルの拡張子は、.bam です。圧縮といっても、単純に gzip や、bzip2 で圧縮したわけではないため、専用のツール (samtools) を使って圧縮や展開を行います。(よって、sam.gz や sam.bz2 ではありません。念のため)

BAM は圧縮されているので、テキストエディタで開いても読めません。通常は、IGVなどのゲノムブラウザに読み込ませて、結果を確認することになります。(ゲノムブラウザでは、手動でSAMに変換することなく、BAMのまま読め場合がほとんどです。)

RNA-seq の場合、マッピング後の結果を比較することになりますが、単純に BAM ファイルどうしを比較するわけではありません。BAMファイルから、各遺伝子ごとに何本のリードがあるのかをカウントする作業が必要になります。