マイクロアレイデータの解析例 1.5 (機能解析の続き)

解析例1のデータのほかのタイムポイントの発現変動遺伝子も、DAVIDで確認してみましょう。

16hr の発現変動遺伝子

前回の 24hr の発現変動遺伝子と同様に、 ratio と Z-score によって判定された発現変動遺伝子を DAVID で確認してみます。

16hr の発現変動遺伝子を DAVID で解析した結果。
16hr の発現変動遺伝子を DAVID で解析した結果。

24hr のときとは異なり、かなり膜系のタンパク、GPCRなどのレセプターの変動が多い印象です。

16hr の比較におけるケラチンのアノテーションクラスター。
16hr の比較におけるケラチンのアノテーションクラスター。

また、ケラチンを含むアノテーションクラスターも上位にあります。Enrichment Score = 1.88  で有意といえます。(1.3を超えているので。)

16hr の比較におけるアポトーシスのアノテーションクラスター。
16hr の比較におけるアポトーシスのアノテーションクラスター。

一方、アポトーシスを含むアノテーションクラスターは、24hr のときと同様に、それほど多くありません。

40hr の発現変動遺伝子

同様に 40hr のタイムポイントにおける発現変動遺伝子も確認してみました。

40hr の発現変動遺伝子を DAVID で解析した結果。
40hr の発現変動遺伝子を DAVID で解析した結果。

トップは、 T-cell activation です。また、16hr と同様に膜系、レセプターが上位にきていますが、Enrichment Score は下がっています。(他の機能に分散している?)

40hr の比較におけるケラチンのアノテーションクラスター。
40hr の比較におけるケラチンのアノテーションクラスター。

ケラチンの変動はあまり見られなくなっています。16hr, 24hr, 40hr とだんだん変化がなくなるということでしょうか。

40hr の比較におけるアポトーシスのアノテーションクラスター。
40hr の比較におけるアポトーシスのアノテーションクラスター。

アポトーシス関連遺伝子の変動は、やはり少ないようです。

全体を通して、個人的には、アポトーシスの影響は小さいように感じました。また、増殖系への影響も少なそうです。膜タンパクの影響もありそうですが、24hr でいったん少なくなるのが解釈に困るような気がします。

今回の解析の内容は、あくまで主観的なものです。論文の内容を確認していませんし、フェノタイプに変化があるなら、必ずしも、DAVIDのスコアが高い必要はないと考えます。

 

DAVID 操作ガイド3

8. 解析結果1:アノテーションの解析結果を見る例です。ここでは、”Functional
Annotation Clustering” を見る方法を解説します。中程の ”Functional Annotation Clustering” のボタンをクリックします。

新しいウィンドウに解析結果が表示されます。Functional Annotation Clustering では、同じような機能を持った遺伝子群を1つのクラスターとして考え、スコアの高いクラスターの順に表示されます。1つのクラスターには、metabolic process, anion transport などの Gene Ontology (GO) が複数含まれています。アップロードした遺伝子リスト中、それぞれの GO をアノテーションに持つ遺伝子は、GO の隣の青いバーをクリックすることで見ることができます(Gene Report)。 P_Value は、0.05 (5.0E-2)以下が統計的に有意と判断される目安です。

青いバーをクリックして表示される Gene Report は、右上の “Download file” をクリックすることで、ダウンロードできます。

ダウンロードした Gene Report は、Excel で読み込むことができます。開くときに、選択対象を ”すべてのファイル” とします (“すべての読み込み可能なファイル”ではなく)。

9. 解析結果2:パスウェイを表示させる例です。 Annotation Summary Results の画面(7. の画面)の “Pathways (3 selected)” を選択します。

同じウィンドウの中にアノテーション情報として登録されているパスウェイデータベースの一覧が表示されます。パスウェイデータベースの横の数字は、 アップロードした遺伝子リストのうち、パスウェイデータベースにヒットした割合と個数です。 “Chart” ボタンをクリックすると、 “Functional Annotation Chart” のウィンドウが表示されます。また、Chart ボタンの隣の ”青いバー” をクリックすると、 ”Functional Annotation Table” のウィンドウが表示されます。さらに、それぞれのウィンドウにおいて、各パスウェイ名をクリックすると、パスウェイの画像を表示できます。

パスウェイデータベース(ここでは KEGG )に登録されている ”Apoptosis” や ”Cell Cycle” といった個々のパスウェイの中から、アップロードした遺伝子リストに含まれる遺伝子が載っている(マップされる)パスウェイを探すには、 ”Functional Annotation Chart” を参照します。スコアに関係なく、マップされるパスウェイを知りたい場合は、”Functional Annotation Table” を参照します。

Functional Annotation Chart ウィンドウには、アップロードした遺伝子リスト中の遺伝子を、統計的に有意な割合で含むパスウェイだけが表示されます。 “Term” 中の各パスウェイ名をクリックするとパスウェイが表示されます。

Functional Annotation Table ウィンドウには、アップロードした遺伝子リストのうち、パスウェイデータベースにヒットした遺伝子の一覧が表示されます。各パスウェイ名をクリックするとパスウェイが表示されます。パスウェイの数が多い場合は、ブラウザの検索機能を利用すると便利です。

マップされたパスウェイの例:下図は、”Cell Cycle” のパスウェイにマップされた場合の例です。アップロードした遺伝子リストに含まれていた遺伝子は、星印をつけて表示されます。各遺伝子をクリックすると、遺伝子について詳細な情報を見ることができます。

Reference
Huang et al. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols (2009) vol. 4 (1) pp. 44-57.

 

DAVID 操作ガイド2

1. DAVIDにアクセスします。
http://david.abcc.ncifcrf.gov/

2. ショートカットメニューから、 “Functional Annotation” を選択します。

3. Functional Annotation Tool が表示されます。左側のメニューの “Upload” タブを選択します。遺伝子リストをアップロードするフォームが表示されます。

4. Excel で、解析結果を開き、ProbeSetID の列をコピーします。(下図は Affymetrix の場合です。それ以外は、GenbankAccesstion などを用います。)

5. Step 1: Enter Gene List の “A: Paste a list” の枠内に、コピーしたリストを貼付けます(この場合、B: のファイルを選択する必要はありません)。

6. Step 2: Select Identifier が、 ”AFFY_ID” になっていることを確認します。( 4. で、GenbankAccession を選択した場合は、 Select Identifier に、”GENBANK_ACCESSION” を選択します。) さらに、 Step 3: List Type が、”GeneList” になっていることを確認します。最後に、 Step4: Submit List の “Submit List” のボタンをクリックします。(数十秒から数分程度時間がかかります。)

7. 遺伝子リストのアップロードが完了すると、次のような画面になります。対象となる生物種名を候補の中から選択し、”Select” ボタンをクリックします。右側に選択した生物種が反映された Annotation Summary Results が表示されます。

 

DAVID 操作ガイド1

DAVID は、National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) によって提供されるデータベースで、無料で利用できます。
個々の遺伝子に割り当てられた注釈( アノテーション)情報を解析できます。おもに下記のような解析を行えます。

続きを読む DAVID 操作ガイド1