遺伝子発現解析（マイクロアレイ解析, RNA-seq）

ヒストグラム（histogram, 度数分布）

シグナル値の分布に偏りがあるかどうかは、ヒストグラムを書いてみると分かります。ヒストグラムでは、横軸にシグナル値の大きさ、縦軸に一定のシグナル値の区間に存在するプローブ（遺伝子）の数を表します。また、普通の等間隔の目盛では見づらいため、横軸に対数目盛を用います。



図：シグナル値のヒストグラム：普通の目盛（左）と対数目盛（右）。左の横軸は指数表示になっているが、0, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000 ということ。同じデータを使用*[1]。

 

マイクロアレイデータのヒストグラムは、おおむね図のような形状になります。（メーカーによって、若干の違いはあります。）シグナル値が、かなり低いところに大きな尖った山ができます。また、その右側は比較的なだらかな山が、シグナル値が数十万となるところまで続きます。
尖った山は、この部分に分布している遺伝子の数が極端に多いことを意味します。だいたい、4万個の遺伝子中、約1万個の遺伝子が、この部分に含まれるケースが多いです。ここに含まれる遺伝子のシグナル値は、1桁から2桁程度であり、マイクロアレイにより検出されていない*[2]可能性が高い遺伝子です。シグナル値が低くても、マイクロアレイデータから発現していないと言い切ることはできません*[3]。しかしながら、イメージとして、どのような細胞であっても、その中で1万遺伝子程度は、発現していないというのは生物学的に自然なことではないでしょうか。
右側の比較的なだらかな山は、残りの3万個程度の遺伝子が、数百から数十万までの区間に広く分布していることを意味します。通常、この部分に偏りは少なく、シグナル値の高い区間になるほど、そこに分布する遺伝子の数は、少なくなっていきます。つまり、マイクロアレイでは、高いシグナル値になるほど、稀な値だということです。

 

ヒストグラムから分かること

シグナル値の分布の偏りが分かります。検出されていない遺伝子の山以外の比較的なだらかな部分に、極端に高い凹凸があれば、データのクオリティが疑われます。

 

ヒストグラムから分からないこと

特定の遺伝子に発現変動があるかどうかは、ヒストグラムからも判別できません。（それには、散布図を用います。）ヒストグラムは、1サンプルに1つ書けますが、ボックスプロットのように複数のサンプルを並べて同時に比較することには向きません。

 

ここまでのまとめ

ボックスプロットとヒストグラムから、シグナル値が低い部分に集中している形状を取るのが、マイクロアレイデータの特性と言えます。1桁から数十万まで幅広い値を取ります。また、約4分の1程度は、検出されず、検出された遺伝子も数百程度のシグナル値のものまでが75％を占め、高い値を示すのは残りの1万個程度です。そのため、マイクロアレイデータの解析結果は、これらの事実を考慮した上で、見ていく必要があります。（マイクロアレイは、このようなバイアスを持った測定手法だということが、前提となります。）マイクロアレイデータは、その特性上、発現レベルが低く、微妙な発現変動を示す遺伝子の検出には向かないと考えられます。


[1] GSM830131
[2] 検出されたかどうかは、データにフラグがあれば、その判定を見ます。
[3] シグナル値が低い場合であっても、リアルタイムPCRなど、マイクロアレイより測定精度の高いとされる他の手法では、検出される可能性があります。

数字（シグナル値）が4万行並んだ構造であるマイクロアレイデータを漠然と眺めていても、なかなかイメージはつかみにくいでしょう。そこで、ボックスプロット、ヒストグラム、散布図などの図にすることで、データ全体のイメージをつかむことができます。

 

ボックスプロット（boxplot, 箱ひげ図）

まず、ボックスプロットの例を示します。ボックスプロットは、箱ひげ図とも呼ばれます。シグナル値を点で表し（プロット）、最も小さいものから最も大きいものまで、縦に並べたような図です。一般的に、シグナル値は、最小のものが1桁程度、最大のものが数十万の値となります。そのまま、表示すると見づらいため、縦軸の座標は対数目盛が用いられます。たとえば、1, 10, 100, 1000, 10000, 100000などです。もしくは、log変換された値で表示されます。（その場合の目盛は、2, 3, 4, 5, 6, …,など。）なお、最小値、最大値は、点ではなく、短い横線で表されます*[1]。



図：ボックスプロットの例。普通の目盛（左）と対数目盛（右）。同じデータ*[2]を使用。

 

また、4万個の数字を、4万個の点で表してもよいのですが、ボックスプロットの名の示すように、点が集中している部分は、ボックス（箱）として表現されます。箱の下端と上端には意味があり、下端は、25パーセンタイル、上端は、75パーセンタイルを表します。すなわち、最小値から箱の下端までの区間に全体の25パーセントのシグナル値が存在し、箱の上端までの区間に75パーセントのシグナル値が存在するということです。さらに箱の中央に横線があり、これが50パーセンタイル（=中央値）を示します。

 

ボックスプロットから分かる事

ボックスプロットは、1サンプルにつき、1つ書きます。マイクロアレイデータは、1桁から数十万まで、幅広い値を持つことが見て取れると思います。また、箱の位置と大きさから、大多数のシグナル値（遺伝子）が数十から数百と低い値を持つ事も分かります。箱が75パーセンタイルなので、4万遺伝子中、3万遺伝子のシグナル値は、それほど大きくない*[3]ということです。

 

図：2サンプルのボックスプロット。

複数サンプルがある場合は、それぞれのボックスプロットを横に並べて比較することになります。サンプルによって、最小値も最大値も異なることが分かります。また、中央値や箱の位置も異なっています。ただ、箱の大きさは、それほど変わらないことも分かります。これがどのような状態を意味しているかというと、サンプルによって、データが全体的に上（または下）にシフトしているということです。大きく上下にずれているサンプルどうしで ratio を計算すると、どの遺伝子の ratio も高い（または低い）という結果になってしまいます。そのため、ratio の計算の前に「正規化」という作業が必要になってきます。

また、サンプルの状態が悪いときは、箱の大きさが小さかったり、全体的に大きく下にシフトしていたりすることがあります。これもボックスプロットを書くことで確認できます。

 

ボックスプロットから分からないこと

シグナル値の分布に偏りがあるかどうかは、ボックスプロットから分かりません。また、特定の遺伝子に発現変動があるかどうかもボックスプロットから判定できません。これらを見るためには、マイクロアレイデータを別の図で表現してみる必要があります。

 

[1] 集団から外れている値があれば、横線の外側にプロットされます。
[2] GSM830131
[3] 発現していないということではありません。