遺伝子発現解析（マイクロアレイ解析, RNA-seq） – ページ 31 – 株式会社セルイノベーターによる遺伝子発現解析手法とツールの紹介

マイクロアレイデータの Gene Expression Omnibus (GEO) への登録

GEOへの登録

最近のジャーナルでは、マイクロアレイデータを用いた論文を投稿する際に、マイクロアレイデータの Gene Expression Omnibus (GEO) への登録を求められることが多いです。GEOは、これまでに多くのマイクロアレイデータが登録されており、自由に閲覧が可能なデータベースです。

GEO にマイクロアレイデータを登録すると、”GSExxxxx” という番号をもらうことができます。他の研究者は、この番号を指定することで、そのマイクロアレイデータを閲覧することが可能です。レビューワーから、このアクセッション番号や、IDという言い方で、求められることもあります。

登録する際に準備するもの

GEOにマイクロアレイデータを登録する際に必要なものは、下記の3点です。（ここでは、GEOarchive という形式の登録方法を紹介します。）

NCBI のアカウント（ユーザー名とパスワード）
メタデータ（論文の要旨や、サンプルの情報など。）
マイクロアレイデータ（CELファイルなどのrawデータを含む。）

1. NCBI のアカウント

NCBIを利用するときのアカウントです。NCBIのサイトで無料で作成できます。左下の “Register for an NCBI account” から先へ進みます。（以前は、GEO専用のアカウントがありましたが、現在は、NCBIアカウントに統合されています。）

アカウント作成後、登録されたメールアドレスに、confirm 用のメールが届きます。そのメールに書かれたリンクをクリックすることで、確認されたことになり、アカウントが有効化されます。（迷惑メールと判断されることもあるようですので、ご注意ください。）

2. メタデータ

論文の要旨や、サンプルの情報を専用のエクセルのフォームに記入します。Affymetrix, Agilent, Illumina ごとに専用のフォームがあります。テンプレートのエクセルファイルをダウンロードして記入します。このテンプレートの3枚目以降のシートに記入例があります。各項目の意味はこちらをご覧ください。

3. マイクロアレイデータ

正規化済みのマイクロアレイデータと、これに加えて、rawデータ(AffymetrixであればCELファイル、AgilentであればFeatureExtractionから出力されるファイル)も必要です。ratioやアノテーションの情報は、必須ではありません。プローブIDと、シグナル値と（あれば）フラグの情報を登録します。

正規化に用いたすべてのサンプルの情報が必要です。「8サンプルで正規化を行って解析した後、論文に使用した4サンプルだけを登録」ということはできません。8サンプルで正規化した場合と、4サンプルで正規化した場合では、若干、シグナル値が変わるためです。上記のような場合は、4サンプルだけで再度、正規化から解析しなおして、登録する必要があります。

株式会社セルイノベーターでは、「マイクロアレイデータのGEOへの登録」も受託解析サービスの料金の中に含まれています。登録の際は、ご相談ください。

エクセルで log 変換

エクセルで log 変換をする方法です。下図のようなマイクロアレイデータがあったとします。1サンプルのデータが示されています。（遺伝子数は3個）

B列に表示されているシグナル値を log10 変換してみます。なお、結果をC列に保存するものとします。

(1) まず、C2のセルに “=log10(B2)” と入力します。”=” を忘れずに入力してください。

C2のセルに計算結果が表示されます。（この場合は、1）

(2) 次に、このセルをコピーしてください。

(3) そして、3行目以降のセルを選択した状態で、ペーストします。これで、3行目以降も同様の計算が行われ、計算結果が表示されます。

計算結果が表示されます。底が 10 の変換なので “=log(B2, 10)” でも同じ結果を得られます。 log2変換したい場合は、 “=log(B2, 2)” と入力します。

GO解析(2)

GO解析の考え方

発現が増加または、減少した遺伝子の一群（発現変動遺伝子群）の中に、「特定の用語（機能、キーワード）をアノテーションに持つ遺伝子が多い」ことを述べるには、下記の2つの点を考慮する必要があります。

その用語をアノテーションに持つ遺伝子が、ゲノム中にもともと多いのかどうか。
発現が増加または、減少した遺伝子の数が多いかのどうか。

1. について

もともとゲノム中に多く含まれる機能は、当然、発現変動遺伝子群においても見つかりやすいです。たとえば、 GO:0005488 : binding は、ほとんどの遺伝子がこの機能をアノテーションされています。（何らかのタンパクと結合することが考えられますので、当然といえます。）GO:0016020 : membrane などもそうです。ほとんどの遺伝子は、膜系か、それ以外に分類されるためです。

「当たり」が多く含まれている宝くじを引いていることをイメージするとよいでしょう。それでは当たったことが重要にはなりません。

2. について

発現が増加または、減少した遺伝子の数が多い場合、あらゆる機能の遺伝子が見つかりやすくなります。マイクロアレイデータによっては、3000個以上の遺伝子が増加、減少していることもあります。この状態では、ほぼすべての機能の遺伝子が含まれていて当然と考えられます。

宝くじをたくさん引いていることをイメージするとよいでしょう。何度も挑戦することで、当然、当たりやすくなるため、当たったことの重要性は薄れます。

好ましい状態

上記を考慮すると、最も重要性が高くなるのは、次の条件です。

「もともとゲノム中に数少なく見られる機能を持つ遺伝子が、少ない発現変動遺伝子群に数多く含まれている。」

言い換えると、「ゲノム中（4万個）に10個程度しか含まれない遺伝子が、マイクロアレイ解析の結果、変動していた100個の遺伝子群の中に、8個も見つかった」というような状況です。（数字は適当です。）

DAVID の解析結果などに表示されている GO についた p-value や Enrichment Score は、上記の点を考慮して算出されたものです。 p-value < 0.05 であれば、偶然ではないことが主張できます。

GO解析 (1)

GO解析とは

マイクロアレイ解析の結果、まず得られるのは、発現が増加または減少した遺伝子（発現変動遺伝子）のリストです。一般的には、エクセルの表の形で扱われることが多いと思います。

そのリストを眺めて（または検索して）いると、「特定のGO用語（機能、キーワード）が多く含まれているようだ」ということが直感的に分かると思います。

例えば、GOの列に GO:0006954 : inflammatory response が多いなぁ、というように。

では、どれくらいの頻度で見つかれば、特定の用語が見つかる頻度が高い（エンリッチされている）と言えるのでしょうか？発現変動遺伝子が100個あったとして、10個見つかれば、いいほうなのでしょうか？何個 “inflammatory response” が見つかれば、「マイクロアレイ解析の結果、炎症系の遺伝子に影響があった」と言えるのでしょうか？

これに答えるのが、「GO解析」です。GO解析(2) へ。

SQL言語 (MySQL)

SQL言語を使った遺伝子の選択

マイクロアレイのデータを処理するときに知っておくと便利なツールとして、SQL言語があります。コンピューターにいろいろな命令を出すのが、プログラミング言語と呼ばれるものです。その中でもデータベースの処理に特化した言語が、SQL言語です。（SQL言語にはいくつかの種類があり、ここでは MySQL という種類を用います。）

プログラミング言語の中でも、SQL言語は、人間にも比較的読みやすい言語です。例えば、次のようなものです。

SELECT ProbeID, GeneSymbol
FROM 'アノテーションのテーブル名';

アノテーションのデータが、データベースのテーブルに格納されていれば、このような表現で、ProbeID と GeneSymbol の一覧を取得できます。

アノテーションの GO に “tumor” を含む遺伝子すべてを取得するには、次のようなSQL（クエリー）を用います。

SELECT a.ProbeID, a.GeneSymbol, a.GO, d.Sample1, d.Sample2
FROM annotation a
INNER JOIN data d
ON a.ProbeID = d.ProbeID
WHERE a.GO LIKE '%tumor%';