タグ: 発現変動遺伝子

マイクロアレイにおいて、シグナル値の低いものは、信頼性（データの再現性）がよくない場合があります。これは、MAプロットや散布図の形状からも推測されます。（同一条件で比較したサンプルにおいても、シグナル値の低い部分に変動が見られがち。）

例えば、シグナル値が、1000から10000になったら、ratio=10ですが、10から100になっても同じ ratio=10 です。ratio だけで、発現変動遺伝子を判定すると、特にシグナル値の低い部分に、ratio が高い遺伝子が見つかりがちですが、再現性を考えた場合、少し不安です。

一方、 Z-score で判定した場合も、MA プロットから分かるように、シグナル値の高い部分は、Z-score が高くなりにくい傾向があります。

この2点の問題を解消するために、  Intensity-based Z-score (Intensity-dependent Z-score)* というものがあります。（以前から提案されているもので、珍しい手法ではありません。）

Intensity-based Z-score

Intensity-based Z-score では、文字通り、Intensity (=シグナル値の強さ) を考慮した Z-score です。マイクロアレイデータをシグナル値の大きさごとに一定の区間に分割して、その区間ごとに logFC の平均値と標準偏差を求めます。そして、それぞれの区間ごとに、Z-score を算出します。

そうすることで、シグナル値の低い部分は、大きい標準偏差 (SD) を用い、一方、シグナル値の高い部分は、小さい SD を用いて Z-score を判定することになります。したがって、シグナル値の低い部分は、通常の Z-score より判定条件が厳しくなり、シグナル値の高い部分は、判定条件が緩くなります。

MAプロットで確認すると、違いがよくわかります。ここでは、便宜的に、シグナル値の大きさによって8区間に分割して、Z-score を算出しています（図下）。（8つという区間に必然性はありません。もう少し細く区切ってもよいです。）また、Intensity-based Z-score を使用した図は、事前に使用した2サンプルのフラグが、共にA（absent: 未検出）のプローブを除外しています。

図形的には、変動している遺伝子を外側から数パーセント取るという形になります。単純に ratio で判定するよりも慎重な方法といえるでしょう。しかしながら、これも万能な手法というわけではありません。可能であれば、繰り返しサンプル (replicates) が、3サンプル以上 (n=3以上) あって、検定などの手法が使える方が望ましいことには変わりません。

参考

* Quackenbush. Microarray data normalization and transformation. Nat Genet (2002) vol. 32 Suppl pp. 496-501.

 

MAプロットで確認すると、 ratio と Z-score の関係が、分かりやすいと思います。解析例1のデータ (sample2/control2) においては、ratio=2 のラインより、2SDのラインが外側にあります。この場合は、 Z-score のほうが厳しい判定と言えます。（追記：この例の場合、2SD=約1.344 (logFCで)、ratio > 2.54 が Z-score > 2 のラインです。）

また、 logFC を Z-score 化して、発現変動遺伝子の判定を行う場合、利点と欠点があります。

Z-score を判定に用いた場合の利点

単純に ratio で判定する場合に比べて、下記のような利点があります。

• 判定の基準で迷わない。
• 発現変動が大きいデータの場合、カットオフに使える。
• 発現変動が小さいデータでも、発現変動遺伝子を判定できる。

Z-score > 2 または、 Z-score < -2 ということに、統計学的な意味があるので、判定の基準をいくらぐらいにしようかということで迷う必要はありません。（2 以下にあまり意味がありません。）

また、発現変動が大きいデータの場合、ratio > 2, ratio < 0.5 などで判定すると、4000個、5000個の遺伝子が、発現変動ありとなることもあります。そのような大きいデータの場合、 Z-score で判定することで、発現変動遺伝子の数を1000個から2000個程度に減らせます。（発現変動遺伝子が多すぎても困ることがあります。例えば、DAVID で1度で解析できる遺伝子の数は、3000個です。）

逆に、サンプルによっては、たかだか1.5倍程度しか変動しないような、小さい発現変動のデータもあります。そのような場合、Z-score だけで判定すれば、（ratioの大きさに関係なく）変動している遺伝子の上位5%程度を取ることになるので、必ず、変動遺伝子を得られます。

Z-score を判定に用いた場合の欠点

利点の裏返しです。

• 判定が厳しすぎるときがある。
• シグナル値が高い部分で、|Z-score| > 2 に比較的なりにくい。

例えば、研究対象としている遺伝子があり、 ratio だと 2 倍を超えているのに、 Z-score だと、 1.7 というようなケースです。Z-score  が2以下だからといって、「変動していない」という証明になるわけではありませんが、印象が良くないかもしれません。

また、散布図やMAプロットの先が細いということからも見えることですが、シグナル値の高い部分は、変動が小さく見えがちです。シグナルの高い部分にも、シグナルの低い部分と同程度の標準偏差を求めるならば、高い部分は、|Z-score| > 2 になりにくいといえます。

しかしながら、そもそも、変動が大きすぎたり、変動が小さい場合は、まず、サンプル数（n数）を増やすことを考えるべきです。n=3以上にして、limma, SAM, t-test などの検定を行ったほうが、p-value も算出できますし、より再現性の高い遺伝子を変動ありと判定できます。